градуировка хроматографа с использованием стандартных образцов

Шушечка пишет:
. но работая на ГХ стандарт колю всегда, когда есть необходимость.

Шушечка пишет:
. Отклик прибора тоже может измениться.

Верно! И поэтому методиками установлены рамки, в пределах которых допустимо изменение. И если мы вкалываем стандарт 1 ppb и получаем результат 0,95 ppb (по сделанной когда-то градуировке), и методикой этот люфт в 5% допустим, то ок, работаем дальше по старой градуировке, а вот если получили 0,5 ppb, то ГХ барахлит, условия изменились, стандарт выдохся, вкололи криво и тд. Соотвественно, принимаем меры к выявлению причин. А по этим РД получается (если я верно все понял), что мы раз в год проверили линейность и забыли о ней. Работаем только с одним единственным стандартным раствором. Какой отклик дает ГХ на него такой и ладно.

После просмотра РД по диагонали сложилось следующее мнение:

— расчет описан по 1 (одному) град. раствору, но разработчики не дали себе труда уточнить, какой это именно раствор, примененный ранее, или одновременно с пробой (считаю, что второе)
— проверка линейности описана таким образом, что это действие предпринимается скорее для проверки пригодности системы (ГХ) в части линейности отклика, чем для проверки ранее уставновленной град.зависимости

Tigra пишет:
Спасибо за интерес к моему вопросу.

Верно! И поэтому методиками установлены рамки, в пределах которых допустимо изменение. И если мы вкалываем стандарт 1 ppb и получаем результат 0,95 ppb (по сделанной когда-то градуировке), и методикой этот люфт в 5% допустим, то ок, работаем дальше по старой градуировке, а вот если получили 0,5 ppb, то ГХ барахлит, условия изменились, стандарт выдохся, вкололи криво и тд. Соотвественно, принимаем меры к выявлению причин. А по этим РД получается (если я верно все понял), что мы раз в год проверили линейность и забыли о ней. Работаем только с одним единственным стандартным раствором. Какой отклик дает ГХ на него такой и ладно.

Единожды построив калибровку этого достаточно. На самом деле это ни фига не калибровка, а просто подтверждение линейности. Зачем каждый раз изводить стандарт, доказывая линейность методики? НЕсколько раз колю СО и смотрю погрешность.
Согласна с КЭТ, именно так и провожу. Этого предостаточно.

Змееед пишет:
После просмотра РД по диагонали сложилось следующее мнение:

— расчет описан по 1 (одному) град. раствору, но разработчики не дали себе труда уточнить, какой это именно раствор, примененный ранее, или одновременно с пробой (считаю, что второе)

Змееед пишет:
— проверка линейности описана таким образом, что это действие предпринимается скорее для проверки пригодности системы (ГХ) в части линейности отклика, чем для проверки ранее уставновленной град.зависимости

Не совсем согласен. Скорее данные РД вообще предлагают не строить градуировочную кривую для количественных расчетов, а ограничиться проверкой линейности отклика детектора. И затем эту линейность (условно назовем так построенную зависимость величины отклика от концентрации) не использовать вообще никак. А количественный расчет вести по какому-нибудь одному стандартному раствору, вколотому перед серией проб (т.е. перед тем количеством, которое измеряется за смену).

Хроматографистка Кэт пишет:
Колю стандарт одного пестицида или смесь нескольких перед каждой серией измерений. Новую калибровку, как правило, делаю после чистки детектора (1-2 раза в год) и перед сличительными испытаниями.

Я так понимаю, что количественный расчет Вы (точнее ПО хроматографа) делаете по этой самой калибровке, построенной 1-2 раза в год? А стандарт Вы вкалываете именно для проверки не изменилось ли состояние ГХ настолько сильно (какой-то люфт все равно допустим), что калибровка уже не пригодна для количественных расчетов проб?

Шушечка пишет:
Единожды построив калибровку этого достаточно.

Так и я о том же! 1-2 раза в год построили градуировку по нескольким точкам и используем ее в течение полугода-года. Используем! Вкалывание одного стандарта перед серией проб используем только и исключительно для оценки погрешности. Но эти РД как раз и описывают совершенно противоположный подход! Мой вопрос в том и состоит: насколько этот РД-шный подход адекватен и метрологически правилен.

Tigra пишет:
Мой вопрос в том и состоит: насколько этот РД-шный подход адекватен и метрологически правилен.

Если вдруг неадекватен и неправилен, то не будете делать?
Я не вижу принципиальных преимуществ и дополнительной мифологической «правильности» в любом предложенном в теме варианте. «Неправильную» методику нельзя аттестовать, хотя сейчас можно аттестовать даже сборник анекдотов.
Ну и не забудьте, что даже если в 5 анализах из 100 вы выйдете за пределы погрешности методики, вам за это ничего не будет, если P=0,95.

Tigra пишет:
Я так понимаю, что количественный расчет Вы (точнее ПО хроматографа) делаете по этой самой калибровке, построенной 1-2 раза в год? А стандарт Вы вкалываете именно для проверки не изменилось ли состояние ГХ настолько сильно (какой-то люфт все равно допустим), что калибровка уже не пригодна для количественных расчетов проб?

Да, именно так. Как показывает практика, если не было никаких вмешательств в прибор, одной калибровки хватает дожить от одной поверки до другой.

Ответов в этой теме: 14
Страница: 1 2
«« назад || далее »»

Источник

Большая Энциклопедия Нефти и Газа

Градуировка хроматографа состоит в определении градуировочного коэффициента К. [1]

Градуировка хроматографа состоит в определении градуи-ровочного коэффициента К. [2]

Градуировка хроматографа состоит в определении градуировочного коэффициента К для каждого из определяемых компонентов. [3]

Градуировка хроматографа состоит в построении градуи-ровочного графика для определяемого компонента. График строят при помощи ПГС, содержащих водород в массовых долях, охватывающих весь возможный интервал измерения концентрации его в анализируемых пробах. Снимают хромато-граммы с разной массовой долей водорода при одинаковом количестве введенной пробы, измеряют высоты пиков и строят график в координатах А. [4]

Градуировку хроматографа проводят методом абсолютной калибровки по градуировочным смесям, содержащим стирол в заданном диапазоне измерений. [5]

Градуировку хроматографа проводят не реже, чем 1 раз в год, а также при смене насадок в колонке и патроне и изменении условий хроматографического определения. [6]

Градуировку хроматографов следует проводить потребителям с использованием реальных измеряемых веществ с учетом специфики конкретной аналитической задачи. Поэтому для выпускаемых промышленностью хроматографов нормируются только инструментальные и метрологические свойства приборов. Нормированию подлежат следующие метрологические характеристики: среднее квадратическое отклонение выходных сигналов во всем диапазоне измерения концентрации, приведенное к определенному значению выходного сигнала; временная стабильность выходных сигналов за определенный промежуток времени; случайные составляющие погрешности установки заданных температур термостатируемых узлов; случайные составляющие погрешности установки заданных расходов газов; относительное изменение расходов газов при изменении температуры окружающей среды; относительное изменение расходов газов при изменении барометрического давления; случайные составляющие погрешности деления выходного сигнала. [7]

Градуировку хроматографов осуществляют потребители на реальных анализируемых смесях с учетом специфики конкретной аналитической задачи, обусловливающей выбор выходного сигнала, режимов работы элементов измерительной системы, технологию подготовки хроматографа к выполнению измерений. [8]

Периодичность градуировки хроматографа зависит от режима его работы и требований, предъявляемых к результатам анализа. При поверке градуировочной характеристики потокового хроматографа приходится анализировать искусственные смеси вместо производственных. [10]

Подготовку колонки, градуировку хроматографа и отбор проб см. в разд. [13]

Подготовку колонок, градуировку хроматографа и отбор проб см. в разд. [14]

Подготовку колонки, градуировку хроматографа и отбор проб см. в разд. [15]

Источник

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ): сайт технической поддержки

ЭЛСИКО: Ваши безграничные возможности в жидкостной хроматографии

Глава 1.5. Количественный анализ в ВЭЖХ

Глава 1.5. Количественный анализ в ВЭЖХ

1.5.1. Градуировка. Методы внешнего и внутреннего стандарта

Задача количественного анализа состоит в определении концентрации аналита в пробе. Концентрация (concentration) может быть выражена в единицах количества аналита на количество образца, или количества аналита на объем (жидкого) образца. Термин «количество» (quantity, amount) будет употребляться в широком смысле: и как количество, и как масса вещества – если обратное не будет оговорено отдельно. Вопрос пересчета концентраций не будет затронут в книге.
В большинстве случаев конечные результаты анализов представляют в единицах массовой концентрации, то есть как массу определяемого вещества на единицу массы образца (см. табл. 4); в работе лучше применять российские обозначения: мг/кг, мкг/кг и т.д.

Таблица 4. Единицы массовой концентрации
Отношение массы аналита к массе образца
Международное обозначение единицы концентрации
Российское обозначение единицы концентрации

1 на 100 % %
1 на 1 000 000 ppm мг/кг, мкг/г
1 на 1 000 000 000 ppb мкг/кг, нг/г
1 на 1 000 000 000 000 ppt нг/кг, пг/г

В хроматографии решение задачи количественного анализа достигается путем сравнения площади пика аналита с площадью пика стандартного образца аналита известной концентрации. Установление соответствия между концентрацией аналита в стандартном образце и площадью его пика на хроматограмме в выбранных условиях называется градуировкой (в международном варианте – калибровка, calibration).
Существует два основных способа градуировки: один способ называется методом внешнего стандарта, другой – методом внутреннего стандарта.
Говоря о «внешнем» стандарте, подчеркивают, что анализ стандарта проводится отдельно от анализа пробы. Алгоритм метода внешнего стандарта достаточно прост (см. рис. 80а):

1. проводят анализ смеси стандартных образцов известной концентрации, размечают пики стандартов и измеряют их площади;
2. для каждого стандарта аналита рассчитывают значение абсолютного фактора отклика;
3. затем (в общем случае – в тех же условиях) проводят анализ пробы, размечают пики аналитов и измеряют их площади;
4. зная площадь пика аналита, а также абсолютный фактор отклика, для каждого аналита производят расчет его количества в аликвоте пробы, введенной в хроматограф.

Выведем формулу расчета для метода внешнего стандарта. Количество аналита nан, которое содержится в объеме пробы, непосредственно введенной в хроматограф:

Cпр – концентрация аналита в пробе,
Vпр – объем пробы, вводимой в хроматограф.

Отношение количества аналита к количеству (или массе) стандарта равно отношению площадей их пиков. Выражаем это в виде пропорции:

nан/nст = Sан/Sст, где

nст – количество стандарта в объеме стандартного образца, введенного в хроматограф,
nан – количество аналита в объеме пробы, введенной в хроматограф,
Sст – площадь пика стандарта,
Sан – площадь пика аналита.

Соответственно, для каждого из аналитов на рисунке 80а можно записать соответствующую формулу расчета:

nан1 = nст1/Sст1 * Sан1;
nан2 = nст2/Sст2 * Sан2;
nан3 = nст3/Sст3 * Sан3.

Отношение nст/Sст называется абсолютным фактором отклика для данного аналита. В дальнейшем, nан можно перевести в объемную концентрацию аналита в жидкой пробе: Cпр = nан / Vпр.

Рисунок 80. К иллюстрации методов внешнего (а) и внутреннего (б) стандартов

Теперь рассмотрим метод внутреннего стандарта; он несколько сложнее, чем метод внешнего стандарта. В нем, кроме аналитов и их стандартов, присутствует еще один (точнее, по крайней мере один) стандартный образец, который называют внутренним стандартом (internal standard, IS). При проведении анализа внутренний стандарт добавляют как в смесь стандартных образцов, так и в пробу (см. рис. 80б). Количество вносимого внутреннего стандарта, как правило, фиксировано. При проведении количественного определения площади пиков стандартов и аналитов сравниваются не напрямую, а косвенно – через площадь пика внутреннего стандарта. Алгоритм метода таков:

1. проводят анализ смеси стандартных образцов аналитов и внутреннего стандарта, размечают пики и измеряют их площади;
2. для каждого стандарта аналита рассчитывают относительные факторы отклика (относительно внутреннего стандарта);
3. затем (в общем случае – в тех же условиях) проводят анализ пробы с добавкой внутреннего стандарта, размечают пики аналитов и внутреннего стандарта, измеряют их площади;
4. для каждого пика аналита вычисляют отношение площади его пика к площади пика стандарта;
5. зная отношение площади пика аналита к площади пика внутреннего стандарта, а также относительный фактор отклика, для каждого аналита производят расчет его количества в аликвоте пробы, введенной в хроматограф.

Относительные факторы отклика определяются по следующим формулам (для каждого аналита на хроматограмме стандартов, см. рис. 80б внизу):

k1 = (SстIS/Sст1) * (nст1/nстIS);
k2 = (SстIS/Sст2) * (nст2/nстIS);
k3 = (SстIS/Sст3) * (nст3/nстIS), где

k1 – относительный фактор отклика для 1-ого аналита,
Sст1 – площадь пика стандарта 1-ого аналита,
SстIS – площадь пика внутреннего стандарта (на хроматограмме смеси стандартов),
nст1 – количество (или масса) стандарта 1-ого аналита в объеме стандартного образца, введенного в хроматограф,
nстIS – количество (или масса) внутреннего стандарта в объеме стандартного образца, введенного в хроматограф.

Формулы расчета для каждого аналита выглядят следующим образом:

nан1 = k1 * (nIS/SIS) * Sан1;
nан2 = k2 * (nIS/SIS) * Sан2;
nан3 = k3 * (nIS/SIS) * Sан3, где

nан1 – количество (или масса) 1-ого аналита в объеме пробы, введенной в хроматограф,
k1 – фактор отклика для 1-ого аналита,
Sан1 – площадь пика 1-ого аналита,
SIS – площадь пика внутреннего стандарта (на хроматограмме пробы),
nIS – количество (или масса) внутреннего стандарта в объеме пробы, введенной в хроматограф.

На первый взгляд, метод внутреннего стандарта может показаться слишком сложным и даже надуманным. Зачем придумывать еще одно химическое соединение, которое – мало того что необходимо разделить от целевых веществ и примесей – оно еще усложняет формулу расчета концентрации?!
Тем не менее, метод внутреннего стандарта имеет ряд неоспоримых преимуществ. При использовании метода внутреннего стандарта ни объем вводимой пробы, ни точность ее дозирования никак не влияют на точность количественного анализа. Ведь какой бы объем пробы мы не вводили, отношение площадей пиков аналита и внутреннего стандарта будет всегда оставаться постоянным. Применение метода внутреннего стандарта дает возможность в каждом проводимом определении контролировать потери аналитов в процессе подготовки пробы, причем на любой ее стадии. Кроме того, применение внутреннего стандарта уменьшает трудоемкость измерений в случае групповых определений, когда измеряют концентрацию большого числа целевых соединений одновременно.
Таким образом, для сравнительно простых случаев (целевых веществ максимум несколько, для них доступны стандарты, подготовка пробы минимальная или отсутствует) выбор метода внешнего стандарта вполне обоснован. Как только в методике появляется многостадийная подготовка пробы (в особенности это верно для методик группового определения) – метод внутреннего стандарта становится предпочтительным.
К сожалению, метод внутреннего стандарта хорошо реализуется только при наличии достаточно специфичного детектирования, поскольку пик внутреннего стандарта должен гарантированно отделяться от всех других пиков на хроматограмме. Соответственно, метод внутреннего стандарта удобнее применять при масс-спектрометрическом детектировании; более или менее приемлемо также флуориметрическое детектирование. При спектрофотометрическом детектировании попытка реализовать метод внутреннего стандарта может окончиться неудачей, поскольку этот вид детектирования недостаточно специфичен.
Еще одно ограничение: химическое соединение, используемое как внутренний стандарт, принципиально должно отсутствовать в объекте анализа. Иногда бывает очень непросто подобрать такое вещество. В подобных случаях в качестве внутреннего стандарта применяют такие соединения, которые не встречаются в природе, например, фторсодержащие или изотопномеченные.
Кроме того, внутренний стандарт должен быть (по возможности) структурно подобен аналитам, и имитировать их поведение при экстракции, адсорбционной очистке и т.д., что становится особенно важным в методиках со сложной пробоподготовкой.

1.5.2. Измерение и его погрешность. Случайная и систематическая погрешности. Термины по ГОСТ ИСО 5725: точность (accuracy), правильность (trueness), прецизионность (precision), повторяемость (repeatability), воспроизводимость (reproducibility). Вычисление доверительного интервала. Источники погрешности. Вклад влияния шума детектора в общую погрешность измерения

Как известно из философии, измеряется не явление, а параметры его модели. Согласно общепринятой модели, у измеряемой характеристики имеется истинное значение (reference value), однако, при попытке его измерить мы получаем некоторые экспериментальные значения х, каждое из которых отличается от истинного значения на величину, которая называется погрешностью данного измерения (error).
Проведение серии испытаний позволяет вычислить среднее (арифметическое) экспериментальное значение хср. Среднее экспериментальное значение применяется в качестве оценки истинного значения. Разница между истинным и средним экспериментальным значениями называют систематической погрешностью. Разницу между конкретным экспериментальным значением и средним экспериментальным значением называют случайной погрешностью (данного) экспериментального значения.

Рисунок 81. Метрологические характеристики

Сразу определимся с терминами, обозначающими важнейшие метрологические характеристики измерения (все они соответствуют ГОСТ ИСО 5725). Точностью (accuracy) называется мера близости результата измерения к истинному значению. Более точный метод характеризуется как меньшей систематической погрешностью, так и меньшим разбросом экспериментальных значений. Правильностью (trueness) называется мера близости среднего экспериментального значения к истинному, то есть более правильное измерение характеризуется меньшей систематической погрешностью. Прецизионностью (precision) называется мера близости двух независимых результатов измерений, полученных в конкретно установленных условиях, то есть более прецизионное измерение характеризуется меньшим разбросом экспериментальных значений вокруг среднего. Таким образом, мы получаем, что, согласно принятой модели, точность измерения является суммой правильности и прецизионности.
В свою очередь, прецизионность также можно разложить на две составляющие: повторяемость или сходимость (repeatability) и воспроизводимость (reproducibility). Термином «повторяемость» пользуются, говоря о разбросе значений в пределах одной выборки (одной серии экспериментов), а термином «воспроизводимость» – говоря о разбросе средних значений различных выборок, к примеру, результатов, полученных в различных лабораториях (например, при проведении межлабораторных испытаний).
Сначала рассмотрим свойства случайной погрешности. Случайную погрешность нельзя оценить только из одного измерения, но она становится «видимой» при проведении серии измерений.
Основное, что нам требуется – это оценить ее величину и, соответственно, оценить величину диапазона, в котором может находиться истинное значение, если систематическую погрешность полагать равной нулю. Такой диапазон называют доверительным интервалом. Обратите внимание на важность оговорки «если систематическую ошибку полагать равной нулю». Доверительный интервал отражает только величину случайной погрешности, т.е. его применение в полной мере оправдано только в том случае, когда измерение абсолютно правильное, и точность измерения полностью определяется его прецизионностью (или повторяемостью, если речь идет об одной серии измерений). Начнем с теории статистики.
При стремлении количества испытаний к бесконечности распределение экспериментальных значений вокруг среднего приобретает вид Гауссовой кривой, то есть вид нормального распределения (см. рис. 81). Для нормального распределения мерой разброса экспериментальных значений (вокруг среднего) является среднеквадратичное отклонение, СКО, или в международном варианте стандартное отклонение (standard deviation), которое обозначается как σ. СКО, возведенное в квадрат, называется дисперсией σ2.
Абсолютное значение СКО рассчитывают по формуле:

1/√n. Смысл СКО таков: при достаточно большом количестве испытаний вероятность того, что среднее арифметическое серии отличается от истинного значения не более, чем на СКО (то есть находится внутри диапазона хср ± СКО), составляет 0.67 = 67%. Смысл уменьшения СКО при увеличении количества измерений заключается в том, что наличие большего количества данных делает оценку истинного значения по хср более надежной.
Применение напрямую СКО в качестве оценки величины доверительного интервала, тем не менее, не очень удобно. Во-первых, для этого необходимо провести некоторое большое число испытаний, чего на практике никогда не случается; проводят три-шесть (редко десять) измерений в точке при градуировке и два-три при анализе пробы. Во-вторых, 67% – это слишком низкая доверительная вероятность; интуитивно оценка кажется достаточно надежной при доверительной вероятности 90% и более.
Для вычисления доверительного интервала при данном числе испытаний n и заданной доверительной вероятности α величину СКО необходимо умножить на коэффициент Стьюдента t(n,α) (см. табл. 5)

1.5.3. Одноточечная градуировка

Градуировка по одной точке применяется во всех случаях, когда диапазон содержания целевого соединения в пробе известен, и, более того, достаточно узок. Вот три примера таких случаев.
Пример 1. Проводят исследование продуктов питания на безопасность; для расчета концентрации применяют многоточечную градуировку в широком диапазоне. Допустим, что найденная концентрация аналита в нескольких образцах оказывается очень близкой к предельно допустимой (ПДК). Однако, точность метода, разработанного для широкого диапазона, недостаточна для уверенного ответа на вопрос – больше или меньше ПДК содержится в этих образцах. Тогда делают одноточечную градуировку и проводят определение в данных образцах с большей точностью.
Пример 2. Необходимо провести однократное определение содержания аналита. Многоуровневую градуировку строить нет смысла. Тогда вначале проводят предварительное определение с одноточечной градуировкой и оценивают уровень концентрации аналита. Затем готовят градуировочный раствор ожидаемой концентрации, строят новую градуировку, и далее по ней рассчитывают количество аналита.
Пример 3. Производственный контроль продукции, уровень содержания в которой целевого вещества вполне ожидаем. К примеру, определение количества действующего соединения в таблетках.
Процедура градуировки в общих чертах уже была описана, но повторим ее еще раз. Допустим, мы применяем метод внешнего стандарта. Готовим стандартные растворы, концентрация которых равна ожидаемой концентрации аналита сан в пробе. Вводим пробу n раз, получаем n значений площади пика, вычисляем среднее значение площади пика Sст и доверительный интервал (для n и выбранного α).
На градуировочный график (то есть график зависимости площади пика от концентрации) наносим полученную точку (сст, Sст) и доверительный интервал в этой точке (см. рис. 82а). Проводим через нее прямую, уходящую в начало координат – это наша градуировочная прямая. Через начало координат и верхнюю с нижней границами доверительного интервала соответственно проводим две прямые, наклон которых соответствует фиксированной относительной погрешности. Эти прямые (на рисунке пунктиром) обозначают доверительный интервал в окрестности ожидаемой концентрации. Чем выше концентрация, тем шире будет доверительный интервал, выраженный в абсолютных единицах – но выраженный в процентах не изменится (эта простая модель подразумевает независимость относительной погрешности измерения от концентрации).
Допустим, у нас есть возможность проанализировать только одну пробу, и только один раз, т.е. мы готовы к тому, что в такое измерение будет неизбежно привнесена некоторая систематическая погрешность. Тогда анализируем эту пробу, получаем площадь пика аналита Sан. Откладываем на вертикальной оси полученную площадь и проводим через нее прямую, параллельную горизонтальной оси. Она пересекает градуировочную прямую и границы доверительного интервала в трех точках. Средняя точка (пересечение с градуировочную прямой) соответствует искомой концентрации сан, а крайние точки соответствуют границам доверительного интервала, но на этот раз уже для найденного значения концентрации сан ± δ1 (см. рис. 82а).

Рисунок 82. Одноточечная градуировка

Измерение площади пика целевого соединения можно провести и несколько раз. В этом случае мы получим усредненную площадь пика аналита и границы соответствующего доверительного интервала для измеренной площади. Похожее построение (см. рис. 82б) приведет к такому же значению сан, но доверительный интервал δ2 уже будет шире. Что логично, поскольку в этом случае мы жертвуем прецизионностью измерения в обмен на более важную правильность, от которой зависит уровень доверия к результату.
Приведенные графические построения приведены здесь больше для иллюстрации принципа одноточечной градуировки – на практике они не нужны. В методе внешнего стандарта расчет проводят по пропорции, приведенной в гл. 1.5.1, а доверительные интервалы для градуировки и измерения, выраженные в процентах, просто складывают.
Одноточечная градуировка не предназначена для точных количественных измерений в областях, удаленных от ожидаемого значения концентрации ориентировочно более чем на ±30% (эта оценка применима для детекторов с линейным откликом).

1.5.4. Многоточечная градуировка. Применение линейной и нелинейной регрессии; критерии приемлемости аппроксимации

Рисунок 83. Кусочно-линейная градуировка

Но такой метод уже больше не применяют. Компьютер позволяет сделать все немного иначе и при этом значительно проще. А именно – сразу по имеющимся точкам вычислить три аналитические функции для всего диапазона: одна будет градуировочной кривой, и две других – границами доверительного интервала, теперь уже для всего диапазона концентраций.
Этот подход называется аппроксимацией, а вид аппроксимационной функции – регрессией (regression). Если функция – это линия, то регрессия называется линейной (linear regression), если парабола – квадратической (square regression) и т.д. Бывают и более сложные регрессии (кубическая, четвертого порядка), но в хроматографии, как правило, применяют только линейную и квадратическую (см. рис. 84).

Рисунок 84. Многоточечная градуировка с аппроксимацией методом МНК

Таблица 6. Возможная интерпретация коэффициентов корреляции
Значение R2 Возможная интерпретация

Рисунок 85. Тест на нормальное распределение отклонений

Если аппроксимация линейной функцией оказывается неприемлемой, тогда вместо линейной следует попробовать применить квадратическую регрессию. Если неприемлема квадратическая, то кубическую регрессию, и так далее до тех пор, пока корреляция и распределение отклонений не станут удовлетворительными.
Теперь несколько комментариев. Если нас интересует область низких концентраций, то даже при хорошем коэффициенте корреляции ≥ 0.9999 необходимо применять метод взвешенной регрессии.
Если ордината пересечения градуировочного графика с осью у (у-intercept) оказывается меньше ширины доверительного диапазона, аппроксимированного к нулевой концентрации (SEY, standard error/y = 0), то к градуировке можно добавить еще одну точку – начало координат. После этого параметры градуировки необходимо пересчитать.
Не могу не предостеречь от совершения очень простой, но, как показывает личный опыт, очень распространенной ошибки. При проведении количественных определений необходимо помнить о том, что точный результат можно получить лишь для концентраций внутри диапазона, охватываемого градуировкой. Попытка рассчитать концентрацию в точке вне этого диапазона может вообще закончиться курьезно, например, получением отрицательной концентрации (см. рис. 86).

Рисунок 86. К иллюстрации ошибки при проведении определения вне диапазона градуировки

1.5.5. Полуколичественные измерения

Отдельного внимания заслуживают случаи, когда концентрацию аналитов оценивают, не имея их стандартных образцов. Эти случаи можно условно разделить на три категории.
К первой категории относятся случаи, когда количественный анализ осуществляют методом внутреннего стандарта, при этом факторы отклика не определяют экспериментально, а берут их из литературных источников или из официально утвержденных методик.
Ко второй категории относятся случаи, все аналиты когда на первом этапе переводят в меньшее число соединений, для которых стандарты существуют. Полученные производные определяют количественно; на втором этапе пересчитывают концентрацию производных в концентрацию аналитов, используя эмпирические зависимости, взятые из литературных источников или официально утвержденных методик.
К примеру, при оценке общей массовой доли гликозидов флавонолов в листьях гинкго сначала подвергают образец гидролизу; затем количественно определяют три основных агликона, образовавшихся в результате гидролиза: кверцетин, кемпферол и изорамнетин. В принципе, здесь можно и остановиться, используя для результата анализа формулировку «сумма агликонов флавонолов равна [значение] значению», и это будет хороший количественный анализ.
Но часто требуют представить результат именно как концентрацию исходных гликозидов. Как поступают в этом случае? Берут из литературы эмпирические коэффициенты, которые получены в результате исследований данного вида растений; в результате умножения на них концентрации агликонов переводятся в концентрации соответствующих гликозидов. При этом надо хорошо понимать, что полученное значение является достаточно грубой оценкой. Более того, например, при раскрытии фальсификаций этим методом нельзя пользоваться заведомо.
Ко третьей категории относятся случаи, когда концентрацию структурно подобных аналитов оценивают, применяя лишь один стандартный образец одного из целевых веществ. Допущение состоит в том, что факторы отклика для всех аналитов принимают приблизительно одинаковыми. Разумеется, это приближение также является довольно грубым.
При применении этого метода следует помнить, что при градуировке следует применять не массовую, а мольную концентрацию (количество вещества в единице объема). Тогда массовую концентрацию каждого аналита можно будет рассчитать после проведения определения, умножив полученную мольную концентрацию аналита на его молекулярную массу.

1.5.6. Контроль коэффициентов извлечения при помощи метода внутреннего стандарта. Применение стандартов-суррогатов (surrogate standard) и стандартов выхода (recovery standard)

В сложной методике, включающей одну или несколько стадий подготовки пробы, значительная доля погрешности может быть внесена на стадиях экстракции, концентрирования и особенно очистки. Применение метода внутреннего стандарта дает возможность контролировать потери на стадии подготовки пробы в каждом определении. Специальные внутренние стандарты, которые добавляются в образец до экстракции, называются стандартами-суррогатами (surrogate standards). Эти стандарты подбираются таким образом, чтобы их поведение в процессе экстракции, концентрирования и очистки как можно более полно соответствовало поведению аналитов. Поэтому стандарты-суррогаты часто называют стандартами-имитаторами. Если одновременно определяют несколько целевых соединений, которые значительно различаются по своим физико-химическим свойствам, то их делят на группы со сходными свойствами и для каждой группы подбирают индивидуальный стандарт-суррогат.
Для контроля степени извлечения стандартов-суррогатов также применяют метод внутреннего стандарта: в пробу перед вводом в хроматограф вносят известное количество стандарта выхода (recovery standard). Таким образом, расчет концентрации целевых соединений несколько усложняется, поскольку в таком методе применяются уже два типа внутренних стандартов. Здесь определяют как факторы отклика целевых соединений относительно стандартов-суррогатов, так и факторы отклика стандартов-суррогатов относительно стандарта выхода (см. рис. 87).

Рисунок 87. Схема расчета факторов отклика в методе внутреннего стандарта со стандартами-суррогатами и стандартом выхода

В некоторых случаях, обычно при проведении исследований, эту схему усложняют, вводя в экстракт третий тип внутреннего стандарта – стандарт очистки (clean-up standard) – перед стадией очистки экстракта. Смысл заключается в том, чтобы получить в результате измерения раздельные оценки потерь аналитов в результате пробоподготовки – и на стадии очистки, и на стадии экстракции. Такие исследования проводят, к примеру, при разработке аналитических методик, включающих пробоподготовку.

1.5.7. Что такое валидация хроматографической методики

Валидация аналитической методики является процедурой, проводимой для подтверждения ее применимости для проведения данного анализа. Подразумевается, что валидация методики предшествует ее формальному утверждению, то есть аттестации. Не останавливаясь на формальных моментах, постараемся в общих чертах понять, как проводятся такие исследования.
Каждая аналитическая методика содержит ряд декларируемых показателей, которые называют валидационными характеристиками (validation characteristics). Их типичный набор: правильность, повторяемость, специфичность, предел(ы) детектирования, предел(ы) определения, диапазон. Для хроматографических методик важной характеристикой является также устойчивость (robustness).
Специфичность (specificity) надо понимать как возможность повести по данной аналитической методике определение аналитов при возможном наличии в пробе типичных мешающих определению (маскирующих) соединений: основных компонентов матрицы образца, примесей, продуктов деградации и т.д.
Для того, чтобы доказать высокую специфичность методики, можно:
1. набирать обширную статистику на реальных пробах;
2. проводить специальные эксперименты на модельных образцах, содержащих повышенные концентрации компонентов матрицы и типичных примесей;
3. проводить специальные эксперименты по влиянию различных видов воздействий на образец – если показано, что компоненты образца могут претерпевать химические превращения с образованием мешающих определению продуктов деградации.
При недостаточной специфичности аналитической методики в ее тексте желательно указывать ряд дополнительных аналитических процедур, которые можно привлекать для разрешения тех или иных проблем.
Другими словами, перекрывание пика аналита с пиком примеси должно быть событием исключительным. Но уж если оно произошло (более того – если признается, что это происходит нередко), то эта проблема ни в коем случае не должна ставить аналитика в тупик. Методика должна содержать недвусмысленные (unequivocal) указания о том, как поступить в том или ином случае. В принципе, все основные приемы, применяемые для разрешения подобных проблем, были обсуждены в главе 3.3.
Устойчивость (robustness) надо понимать как «запас прочности» методики при воздействии на хроматографическую систему небольших возмущений, которые, тем не менее, могут привести к существенному изменению ее характеристик.
В случае жидкостной хроматографии такими возмущениями могут быть:
— погрешность приготовления элюента;
— погрешность рН элюента;
— неподвижная фаза иного производителя;
— иная температура колонки;
— иная скорость подвижной фазы;
— иной растворитель для приготовления пробы и т.д.
В случае подготовки пробы такими возмущениями могут быть:
— несоблюдение времени экстракции или гидролиза;
— несоблюдение техники экстракции (к примеру, иная скорость перемешивания);
— несоблюдение техники твердофазной экстракции (например, недостаточная осушка картриджа, его недостаточная или чрезмерная промывка) и т.д.
Одним из наиболее часто применяемых способов представления правильности количественного определения при валидации является форма «введено-найдено». Количества введенного в образец стандарта аналита и найденного аналита приводятся рядом с указанием соответствующих доверительных интервалов. Правильность желательно оценивать не менее чем для трех точек диапазона: в середине, в области низких и в области высоких концентраций.
Повторяемость желательно оценивать, по крайней мере, для четырех точек диапазона: при максимальной концентрации, в середине диапазона, на уровне предела определения и между серединой диапазона и пределом определения.

Источник